Бесплатная библиотека всех действующих ГОСТов
www.docload.spb.ru

Все стандарты, размещенные на этом сайте, не являются их официальным изданием и предназначены исключительно для ознакомительных целей.
Электронные копии этих документов могут распространяться без всяких ограничений. Вы можете размещать информацию с этого сайта на любом другом сайте.
Это некоммерческий сайт и здесь не продаются документы. Вы можете скачать их абсолютно бесплатно!
Содержимое сайта не нарушает чьих-либо авторских прав! Человек имеет право на информацию!

 

 

Утвержден

Постановлением

Госстандарта России

от 29 декабря 2003 г. N 402-ст

 

Дата введения -

1 января 2005 года

 

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

 

МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ

ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

 

RAW MATERIAL AND FOOD-STUFFS. METHOD FOR THE IDENTIFICATION

OF GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS (GMO) OF PLANT ORIGIN

 

ГОСТ Р 52173-2003

 

Предисловие

 

1. Разработан: Государственным учреждением Научно-исследовательским институтом питания РАМН (ГУ НИИ питания РАМН), Центром "Биоинженерия" РАН.

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".

2. Утвержден и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. N 402-ст.

3. Введен впервые.

 

1. Область применения

 

Настоящий стандарт распространяется на пищевые сырье и продукты (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения.

Метод основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими праймерами.

 

2. Нормативные ссылки

 

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88. Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75. Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78. Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9656-75. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738-77. Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 14919-83. Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20015-88. Хлороформ. Технические условия.

ГОСТ 24104-2001. Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85. Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ Р 51652-2000. Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия.

 

3. Определения

 

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1. Генетически модифицированные источники пищи: продукты (компоненты), используемые человеком в пищу в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов.

3.2. Генетически модифицированный организм: организм или несколько организмов, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии или содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинацию генов.

3.3. Генная инженерия: совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

 

4. Аппаратура, материалы и реактивы

 

4.1. Амплификатор типа "Терцик МС-2" под микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °C/с [1].

4.2. Прибор для горизонтального электрофореза типа "Mini-Sub Cell GT System" с комплектом кювет и гребенок [2].

4.3. Источник напряжения типа "Power Pac 300" с диапазоном регулируемого напряжения 50 - 300 В [3].

                                           TM

    4.4.  Видеосистема  типа  "Gel Doc 2000  ", предназначенная для ввода в

компьютер,  анализа  и  документирования изображений люминесцирующих следов

ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300 - 400 нм,

чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию) [4].

    4.5. Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.

    4.6. Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °C.

    4.7.  Микроцентрифуга  настольная  типа  Эппендорф (частота вращения не

                -1

менее 12000 мин.  ) [5].

    4.8. Термостат типа "TERMO 24-15" под микроцентрифужные  пробирки  типа

Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 куб. см, диапазон  температур  от 15 °C до

120 °C,  количество  гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания

температуры  -  0,2 °C,  разность  температур  между  соседними  ячейками -

не более 0,5 °C [6].

    4.9.  Аппарат  для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250 -

         -1

3000 мин.  .

4.10. Печь микроволновая (мощностью не менее 400 Вт).

4.11. Весы лабораторные общего назначения высокого класса точности (условное обозначение (II)) с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

4.12. Баня водяная [7].

4.13. pH-метр с набором электродов, с погрешностью +/- 0,1 pH.

4.14. Дозаторы с переменным объемом дозирования:

0,2 - 2,0 куб. мм, шагом 0,01 куб. мм, точностью +/- 1,2%;

0,5 - 10,0 куб. мм, шагом 0,01 куб. мм, точностью +/- 0,8%;

2 - 20 куб. мм, шагом 0,01 куб. мм, точностью +/- 0,8%;

20 - 200 куб. мм, шагом 0,1 куб. мм, точностью +/- 0,6%;

100 - 1000 куб. мм, шагом 1 куб. мм, точностью +/- 3%;

2 - 10 куб. см, шагом 0,1 куб. см, точностью +/- 0,5%.

4.15. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 куб. см.

4.16. Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000 куб. мм; 10 куб. см.

4.17. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25; 50; 100; 200; 1000 куб. см по ГОСТ 12738.

4.18. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные на 25; 100; 1000 куб. см по ГОСТ 1770.

4.19. Пестик тефлоновый или стеклянная палочка по ГОСТ 21400 под размер микроцентрифужной пробирки вместимостью 1,5 куб. см.

4.20. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21. Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

4.22. Кислота борная по ГОСТ 9656, х.ч.

4.23. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. [8].

4.24. Гексадецилтриметиламмониум бромид [9].

4.25. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.

4.26. Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.

4.27. Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.

4.28. Спирт изопропиловый, х.ч. [10].

4.29. Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.

4.30. Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.

4.31. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.32. Вода деионизированная [11].

4.33. Трис(оксиметил)аминометан, х.ч. [12].

4.34. 2-меркаптоэтанол, х.ч. [13].

4.35. Этидий бромистый, х.ч. [14].

4.36. Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА) [15].

4.37. Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70 °C - 72 °C [16].

4.38. ПЦР буфер [17].

4.39. Агароза для электрофореза (тип II) [18].

4.40. Маркер молекулярной массы ДНК [19].

4.41. Стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0) [20].

4.42. Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5) [21].

4.43. Нуклеотиды:

2'-дезоксиаденозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ) [22];

2'-дезоксицитидин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ) [23];

2'-дезоксигуанозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ) [24];

2'-дезокситимидин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ) [25];

4.44. Праймеры на промотор 35S [26]:

35S-1 5'GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 3';

35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3'.

4.45. Праймеры на терминатор nos [27]:

nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3';

nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3'.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

 

5. Отбор проб

 

Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья и пищевых продуктов.

 

6. Подготовка к проведению анализа

 

6.1. Приготовление растворов

6.1.1. Приготовление раствора концентрацией c (Трис-HCl) = 1 моль/куб. дм

В мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 куб. см помещают 12,11 г Трис(оксиметил)аминометана по 4.33, [12] растворяют в приблизительно 80 куб. см деионизированной воды по 4.32, [11]. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7,5, затем доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

6.1.2. Приготовление раствора концентрацией c (NaCl) = 5 моль/куб. дм

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 29,22 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в приблизительно 80 куб. см деионизированной воды, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

6.1.3. Приготовление раствора концентрацией c (NaOH) = 30%

В колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 50 куб. см помещают 3 г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, растворяют в 7 куб. см деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

6.1.4. Приготовление раствора концентрацией c (ЭДТА) = 0,5 моль/куб. дм

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 14,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты по 4.23, [8], растворяют в приблизительно 80 куб. см деионизированной воды. Раствором гидроокиси натрия, приготовленным по 6.1.3, доводят pH раствора до 8,0, деионизированной водой доводят до метки и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

6.1.5. Приготовление лизирующего буфера

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 25 куб. см помещают 0,5 г бромида гексадецилтриметиламмония, растворяют в 10 куб. см деионизированной воды, добавляют автоматическим микродозатором 2,5 куб. см раствора Трис-HCl, приготовленного по 6.1.1, 7 куб. см раствора хлористого натрия, приготовленного по 6.1.2, 1 куб. см раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.4, доводят деионизированной водой до метки, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес. В случае выпадения осадка при хранении раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате по 4.8, [6] при температуре 65 °C до полного растворения.

Непосредственно перед использованием в приготовленный раствор добавляют автоматическим микродозатором меркаптоэтанол по 4.34, [13] из расчета 4 куб. мм на 1 куб. см лизирующего буфера и перемешивают.

6.1.6. Приготовление хлороформа, насыщенного водой

В колбу вместимостью 200 куб. см вносят цилиндром по ГОСТ 1770 100 куб. см хлороформа по ГОСТ 20015, добавляют 20 куб. см деионизированной воды по ГОСТ 6709, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч для насыщения.

Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

6.1.7. Приготовление 70%-ного раствора этилового ректификованного спирта

В колбу вместимостью 200 куб. см вносят цилиндром 70 куб. см 96%-ного этилового ректификованного спирта по ГОСТ Р 51652, добавляют 26 куб. см деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

6.1.8. Приготовление раствора концентрацией c (БСА) = 20 мкг/куб. см

В пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 куб. см помещают 0,002 г сухого БСА по 4.36, [15], добавляют 1 куб. см деионизированной воды, перемешивают до полного растворения. Отбирают 10 куб. мм приготовленного раствора и переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 куб. см, добавляют 1 куб. см деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °C - не более 1 мес.

6.1.9. Приготовление смеси нуклеотидов концентрацией c = 4 ммоль/куб. дм

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,2 куб. см вносят 96 куб. мм деионизированной воды, 1 куб. мм АТФ (концентрацией 100 ммоль/куб. дм) по 4.43, [22], 1 куб. мм ГТФ (концентрацией 100 ммоль/куб. дм) по 4.43, [24], 1 куб. мм ЦТФ (концентрацией 100 ммоль/куб. дм) по 4.43, [23], 1 куб. мм ТТФ (концентрацией 100 ммоль/куб. дм) по 4.43, [25], смесь перемешивают.

Срок хранения при температуре минус 20 °C - не более одного года.

6.1.10. Приготовление 1x ТВЕ буфера для электрофореза

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см вносят 10,8 г Трис(оксиметил)аминометана, 5,5 г борной кислоты по ГОСТ 9656 и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают до полного растворения.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

    6.1.11.  Приготовление  раствора  концентрацией  c  (C  H  N Br)  =  10

                                                          21 20 3

мг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 г бромистого этидия по 4.35, [14], растворяют и доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 12 мес.

6.1.12. Приготовление 2%-ного агарозного геля

6.1.12.1. В плоскодонную стеклянную колбу вместимостью не менее 200 куб. см помещают 1 г агарозы по 4.39, [18], добавляют 50 куб. см буфера 1x ТВЕ, приготовленного по 6.1.10, тщательно перемешивают взбалтыванием. Колбу со смесью нагревают в микроволновой печи по 4.10 или на водяной бане при температуре 100 °C и кипятят до полного расплавления агарозы.

6.1.12.2. Расплавленную агарозу, приготовленную по 6.1.12.1, охлаждают при комнатной температуре до 50 °C, автоматическим микродозатором добавляют 5 куб. мм раствора бромистого этидия, приготовленного по 6.1.11, тщательно перемешивают круговыми движениями.

6.1.12.3. Однородную смесь, полученную по 6.1.12.2, разливают в кюветы для электрофореза и с помощью гребенки формируют карманы. Через 15 - 30 мин. после остывания геля гребенку удаляют.

Допускается хранение геля в 1x ТВЕ буфере для электрофореза, приготовленного по 6.1.10, в холодильнике при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 7 сут.

6.2. Подготовка пробы

6.2.1. Две навески анализируемого продукта, навеску стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0) по 4.41, [20] и навеску стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5) по 4.42, [21] массой от 70 до 80 мг каждая помещают в четыре микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 1,5 куб. см. С помощью дозатора добавляют в каждую по 200 куб. мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом по 6.1.5 и немедленно тефлоновым пестиком растирают смесь до получения однородной массы. В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 600 куб. мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом. Смесь тщательно перемешивают тефлоновым пестиком, не допуская образования комков. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".

    6.2.2.  Приготовленные  по 6.2.1 смеси помещают в термостат, инкубируют

при  температуре  65 °C 40 - 60 мин., после чего повторно перемешивают 30 с

на   аппарате  для  встряхивания  и  центрифугируют  7  мин. на  настольной

микроцентрифуге  типа  Эппендорф  по  4.7, [5] при частоте вращения 12000 -

          -1

13000 мин.  .

    6.2.3. Надосадочную жидкость приготовленных по 6.2.2 смесей переносят в

четыре  чистые  микроцентрифужные  пробирки  вместимостью  1,5  куб. см, не

захватывая  частицы  суспензии  из осадка. Затем в каждую микроцентрифужную

пробирку  добавляют  по  400  куб. мм хлороформа, приготовленного по 6.1.6,

перемешивают  на  аппарате  для встряхивания 30 с до образования суспензии.

Полученные  суспензии  центрифугируют  7 мин. на настольной микроцентрифуге

                                              -1

типа Эппендорф при частоте вращения 12000 мин.   при комнатной температуре.

6.2.4. Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.3, из четырех пробирок переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 куб. см, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом и центрифугирование по 6.2.3 повторяют дважды.

6.2.5. Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.4, переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 куб. см, добавляют в каждую из них по 600 куб. мм изопропилового спирта по 4.28, [10], предварительно охлажденного в морозильной камере до температуры минус 20 °C, и перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с.

Полученные смеси помещают в морозильную камеру температурой минус 20 °C не менее чем на 30 мин. для образования осадка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

На данном этапе допускается хранение полученных смесей до 12 ч в морозильной камере при температуре минус 20 °C.

    6.2.6. Смеси, приготовленные по 6.2.5, центрифугируют 6 мин при частоте

                -1

вращения   12000   мин.    при  комнатной  температуре.  Аккуратно  удаляют

надосадочную  жидкость.  Каждый  осадок 2 - 3 раза  промывают  200  куб. мм

70%-ного  этилового  ректификованного  спирта,  приготовленного  по  6.1.7,

каждый  раз  перемешивая  осадки  на  аппарате для встряхивания 15 - 20 с и

центрифугируя   их   на   микроцентрифуге  6   мин.  при  частоте  вращения

          -1

12000 мин.   Тщательно (до последней капли) удаляют надосадочную жидкость.

6.2.7. Осадки, приготовленные по 6.2.6, растворяют в 50 - 100 куб. мм деионизированной воды и получают раствор ДНК.

Растворы ДНК, приготовленные по 6.2.7, непосредственно используют для проведения ПЦР или хранят при температуре минус 20 °C сроком до одного года в морозильной камере.

6.3. Приготовление реакционных смесей N 1 и N 2

6.3.1. Приготовление реакционной смеси N 1 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 куб. см, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 куб. мм деионизированной воды, 52,5 куб. мм 10x буфера для ПЦР с хлоридом магния по 4.38, [17], 26 куб. мм смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 куб. мм праймера на промотор 35S-1 (концентрацией 20 мкмоль/куб. дм) по 4.44, [26], 13 куб. мм праймера на промотор 35S-2 (концентрацией 20 мкмоль/куб. дм) по 4.44, [26], 2,5 куб. мм фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед./куб. мм) по 4.37, [16], 52,5 куб. мм раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.2. Приготовление реакционной смеси N 2 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 куб. см, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 куб. мм деионизированной воды, 52,5 куб. мм 10x буфера для ПЦР с хлоридом магния, 26 куб. мм смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 куб. мм праймера на терминатор nos-1 (концентрацией 20 мкмоль/куб. дм) по 4.45, [27], 13 куб. мм праймера на терминатор nos-2 (концентрацией 20 мкмоль/куб. дм) по 4.45, [27], 2,5 куб. мм фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед./куб. мм), 52,5 куб. мм раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

    6.3.3.  Реакционные  смеси  N 1 и N 2, приготовленные по 6.3.1 и 6.3.2,

центрифугируют на настольной микроцентрифуге 30 с при частоте вращения 3000

    -1

мин.  .   Реакционную   смесь   N  1   разливают  по  90  куб.  мм  в  пять

микроцентрифужных  пробирок  вместимостью  0,2 куб. см  (или  0,5 куб. см в

зависимости  от  типа  используемого  амплификатора)  для  проведения  ПЦР.

Реакционную   смесь   N  2   разливают   по  90  куб.  мм   в  пять  других

микроцентрифужных  пробирок  вместимостью  0,2 куб. см  (или  0,5 куб. см в

зависимости  от  типа  используемого  амплификатора)  для  проведения  ПЦР.

Реакционные смеси N 1 и N 2 готовят непосредственно перед проведением ПЦР.

 

7. Проведение анализа

 

7.1. В первые две пробирки с реакционной смесью N 1 и в первые две пробирки с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1 - 6.2.7, по 2 куб. мм в каждую.

В третью пробирку с реакционной смесью N 1 и в третью пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0), по 2 куб. мм в каждую.

В четвертую пробирку с реакционной смесью N 1 и в четвертую пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), по 2 куб. мм в каждую.

В пятую пробирку с реакционной смесью N 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью N 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 куб. мм в каждую - холостой опыт.

7.2. В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле (20 - 40 куб. мм) вазелинового масла по ГОСТ 3164.

7.3. Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos - в таблице 2.

 

Таблица 1

 


 

УСЛОВИЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ 35S ПРОМОТОРА

 

Стадия  

Тип амплификатора                        

Crocodile II

Gene    
Amp 2400 

Progene  

Trio   

Терцик  
МС-2   

Денатурация

2 мин./98 °C

3 мин./94 °C

3 мин./95 °C

2 мин./96 °C

3 мин./94 °C

Амплификация

8 с/95 °C  
30 с/54 °C 
40 с/72 °C 

20 с/94 °C 
40 с/54 °C 
60 с/72 °C 

36 с/95 °C 
72 с/54 °C 
84 с/72 °C 

30 с/95 °C 
40 с/54 °C 
40 с/72 °C 

20 с/94 °C 
40 с/54 °C 
60 с/72 °C 

Количество 
циклов     

40         

40         

40         

40         

40         

Конечное   
удлинение  

3 мин./72 °C

3 мин./72 °C

3 мин./72 °C

3 мин./72 °C

3 мин./72 °C

Фаза       
остывания  

1 мин./30 °C

1 мин./4 °C

1 мин./4 °C

1 мин./4 °C

1 мин./4 °C

Скорость   
нагрева    

1 °C/с     

0,77 °C/с  

1,5 °C/с   

1 °C/с     

0,77 °C/с  

Скорость   
остывания  

1 °C/с     

3,15 °C/с  

1,5 °C/с   

1 °C/с     

3,15 °C/с  

 

Таблица 2

 

УСЛОВИЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ТЕРМИНАТОРА NOS

 

Стадия  

Тип амплификатора                       

Crocodile II

Gene    
Amp 2400 

Progene  

Trio   

Терцик  
МС-2   

Денатурация

3 мин./95 °C

3 мин./94 °C

3 мин./95 °C

2 мин./98 °C

3 мин./94 °C

Амплификация

20 с/95 °C 
40 с/54 °C 
40 с/72 °C 

20 с/94 °C 
40 с/54 °C 
60 с/72 °C 

36 с/95 °C 
72 с/54 °C 
84 с/72 °C 

30 с/95 °C 
40 с/54 °C 
40 с/72 °C 

20 с/94 °C 
40 с/54 °C 
60 с/72 °C 

Количество 
циклов     

40         

40         

40         

40         

40         

Конечное   
удлинение  

3 мин./72 °C

3 мин./72 °C

3 мин./72 °C

3 мин./72 °C

3 мин./72 °C

Фаза       
остывания  

1 мин./30 °C

1 мин./4 °C

1 мин./4 °C

1 мин./4 °C

1 мин./4 °C

Скорость   
нагрева    

1 °C/с     

0,77 °C/с  

1,5 °C/с   

1 °C/с     

0,77 °C/с  

Скорость   
остывания  

1 °C/с     

3,15 °C/с  

1,5 °C/с   

1 °C/с     

3,15 °C/с  

 


 

7.4. По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 куб. мм смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.

7.5. В отдельный карман геля вносят 8 куб. мм маркера молекулярной массы ДНК по 4.40, [19].

7.6. Гель помещают в камеру прибора по 4.2, [2] для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1x ТБЕ.

Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.

7.7. Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].

7.8. Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях А и Б (не приводятся).

 

8. Обработка результатов анализа

 

8.1. В пробе со стандартом ГМИ (ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), содержащего промотор 35S) должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п.н.). В пробе со стандартом без ГМИ (ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)) и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п.н.).

8.2. В пробе со стандартом ГМИ (ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), содержащего терминатор nos) должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п.н. В пробе со стандартом без ГМИ (ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения состава (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)) и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п.н.

8.3. Интерпретация результатов

8.3.1. Отсутствие в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.

8.3.2. Обнаружение в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н., или одного из них, свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.

8.3.3. В случае обнаружения в одной из параллельно анализируемых проб и отсутствия в другой из параллельно анализируемых проб ПЦР-продуктов необходимо повторить весь анализ с еще одной навеской анализируемого продукта.

8.3.4. Обнаружение в отрицательных контролях ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует о получении ложноположительного результата. Это возможно при загрязнении ГМИ оборудования и/или реактивов. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и дозаторов раствором соляной кислоты (1 моль/куб. дм), заменить реактивы на свежеприготовленные, повторить амплификацию.

8.3.5. Отсутствие в положительном контроле ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Это возможно в случае потери активности одного из компонентов реакционной смеси для ПЦР. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить амплификацию.

 

9. Контроль результатов идентификации

 

Для контроля результатов идентификации используют положительный контроль - раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), и два отрицательных контроля - холостой опыт и раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 41 OR SB-0).

 

10. Требования безопасности

 

10.1. При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007. При работе с раствором бромистого этидия и окрашенным гелем необходимо работать в резиновых перчатках

10.2. Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

10.3. При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. При работе с УФ-излучением необходимо пользоваться защитным экраном и защитными очками.

 

 

 

 

 

Приложение В

(справочное)

 

БИБЛИОГРАФИЯ

 

[1] ТУ 9642-001-4648062-98        Амплификатор "Терцик МС-2"

 

[2] "Био-Рад Лаборатория",        Камера для электофореза "Mini-Sub Cell

    "Bio-Rad Laboratories"        GT System"

    (США), кат. N 170-4406

 

[3] "Био-Рад Лаборатория",        Источник напряжения "Power Pac 300"

    "Bio-Rad Laboratories"

    (США), кат. N 900-7980

 

                                                             TM

[4] "Био-Рад Лаборатория",        Видеосистема "Gel Doc 2000   Gel

    "Bio-Rad Laboratories"        Documentation System"

    (США), кат. N 170-86-16

 

[5] ТУ 9452-007-18240041-00       Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф

                                                    -1

                                  "ТЭТА", 12000 мин.

 

[6] ТУ 9452-001-18240041-99       Термостат "TERMO 24-15"

 

[7] ТУ 46-22-603-75               Баня водяная с электрическим или огневым

                                  подогревом

 

[8] ТУ 113-04-146-84              Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)

 

[9] Корпорация "Сигма Алдрич"     Гексадецилтриметиламмониум бромид

    ("Sigma"), кат. N Н 5882      [C  H  NBr]

                                    19 42

 

[10] ТУ 6-09-402-85               Спирт изопропиловый [CH CHOH CH ]

                                                         3       3

 

[11] ОСТ 11.029.003-80            Вода деионизированная

 

[12] ТУ 6-09-4292-76              Трис(оксиметил)аминометан [NH C(CH OH) ]

                                                               2    2   3

 

[13] ТУ 6-09-08-1024-81           2-меркаптоэтанол [C H OS]

                                                     2 6

 

[14] ТУ 6-09-13-452-75            Этидий бромистый [C  H  N Br]

                                                     21 20 3

 

[15] Корпорация "Сигма Алдрич"    Альбумин бычий сывороточный сухой

     ("Sigma"), кат. N В 4287

 

[16] Корпорация "Сигма Алдрич"    Фермент Tag-полимераза

     ("Sigma"), кат. N Д 1806

 

[17] Корпорация "Сигма Алдрич"    Буфер для ПЦР с MgCl

     ("Sigma"), кат. N Р 2192                         2

 

[18] Корпорация "Сигма Алдрич"    Агароза для электрофореза

     ("Sigma"), кат. N А 6877

 

[19] Корпорация "Сигма Алдрич"    ПЦР маркер 100 п.н.

     ("Sigma"), кат. N Р 1473

 

[20] Корпорация "Сигма Алдрич"    Стандартный образец состава генетически

     ("Fluka"), кат. N 53198      не модифицированного источника пищи

                                  растительного происхождения (Certified

                                  Reference Material IRMM N 410R SB-0)

 

[21] Корпорация "Сигма Алдрич"    Стандартный образец состава генетически

     ("Fluka"), кат. N 44386      модифицированного источника пищи

                                  растительного происхождения (Certified

                                  Reference Material IRMM N 410R SB-5)

 

[22] Корпорация "Сигма Алдрич"    2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты

     ("Sigma"), кат. N Д 4788     тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ)

 

[23] Корпорация "Сигма Алдрич"    2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты

     ("Sigma"), кат. N Д 4913     тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ)

 

[24] Корпорация "Сигма Алдрич"    2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты

     ("Sigma"), кат. N Д 5038     тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ)

 

[25] Корпорация "Сигма Алдрич"    2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты

     ("Sigma"), кат. N Т 9656     тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ)

 

[26] ЗАО "Синтол" Россия          Праймеры на промотор 35S:

     (http://www. syntol.ru)      35S-1 5'GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 3';

                                  35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3'

 

[27] ЗАО "Синтол" Россия          Праймеры на терминатор NOS:

     (http://www.syntol.ru)       nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3';

                                  nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3'

 

 

?????? ??????????? ?????????????-?????????? ??????? ????????.??
  Copyright © 2008 - 2017, www.docload.spb.ru